Nat Commun︱周小明/孙子宜团队根据Sigma-1受体开放式构象揭示其配体进入途径的分子机制

撰文︱姬玉佳

责编︱王思珍 

Sigma-1受体（σ1R）是一种主要位于线粒体相关内质网膜上的非阿片类跨膜受体[1]。与许多膜蛋白受体不同，sigma-1受体还具有伴侣蛋白活性。它参与细胞信号传导、调节受体和离子通道，与多种神经退行性疾病和癌症的发生有关[2]。人源sigma-1受体（hσ1R）的晶体结构[3]显示：sigma-1受体结构为同源三聚体形式，每个单体包含氨基端一次跨膜螺旋（α1）、含配体结合位点的β-桶体、羧基端贴近膜的V形双螺旋束（α4/α5）（图1）。根据分子动力学模拟研究，对配体进入σ1R的途径主要有两种猜测（图1）。一是：β-桶体的构象重排为配体进入sigma-1受体打开一条通道（PATH1）。二是：羧基端V形双螺旋通过结构重排（相当于β-桶体的盖子上形成开口），使配体可以进入配体结合位点（PATH2）。由于缺乏明确的实验证据支持，sigma-1受体的配体进入途径一直存在争议。

2022年3月10日，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室/罕见病中心/中西医结合科的孙子宜研究员、周小明研究员团队在Nature Communications上发表了题为“An open-like conformation of the sigma-1 receptor reveals its ligand entry pathway”的研究，展示了非洲爪蟾σ1R的多个晶体结构，包括开放式构象。连同功能结合分析表明，配体接近σ1R配体结合位点可能是通过羧基末端双螺旋束的蛋白质构象变化实现的，而不是β-桶体的结构变化。因此本研究支持了上述第二种猜测。

第一种猜想（PATH1）中，为了允许配体通过，需要β-桶体进行展开和重新折叠。分子动力学模拟虽然支持这一猜想，但考虑到破坏β-桶体所需的能量消耗，以及将β-桶内部疏水区域暴露在水环境时产生的熵罚，从能量角度并不利于PATH1形成（图1）。

图1. σ1R构象及配体进入的两种可能途径

（图源：Meng F., Xiao Y., et al., Nat Commun, 2022）

为了揭示配体进入的具体途径，作者首先希望在不结合任何配体的情况下得到sigma-1受体的开放构象。出人意料的是，虽然在结晶的过程中作者没有添加任何配体，在解析的结构（xlσ1R_closed-endo）中却发现了一个无法判定的小分子化合物的存在（推测为天然配体分子），且解析的结构为闭合构象，与此前报道的人源σ1R结构相似（图2）。同时，xlσ1R_closed-endo晶体堆积方式以及配体浸泡xlσ1R晶体后得到的受体-配体复合物结构显示，用于浸泡的配体是无法通过PATH1进入xlσ1R的。

图2. xlσ1R与hσ1R构象对比

（图源：Meng F., Xiao Y., et al., Nat Commun, 2022）

随后作者解析了开放式构象（3.56埃分辨率）的非洲爪蟾sigma-1受体结构（xlσ1R_open-endo）。比较xlσ1R的开放式和闭合结构（图3）发现：与xlσ1R_closed-endo相比，跨膜螺旋α1在xlσ1R_open-endo中偏离三聚体中心约18°；另外，α4/α5螺旋在两个结构中也有显著区别：在xlσ1R_open-endo中，α4螺旋稍微远离α5螺旋并偏转，配合来自α5螺旋的Tyr203残基侧链的向内旋转，在α4和α5螺旋之间产生了一个开口，其大小允许配体从外部进入配体结合位点。这正符合之前猜想二中提出的访问路径PATH2（图1）。为了验证这种变化具有生理意义，作者通过共晶和浸泡实验分别解析了xlσ1R与配体PRE084形成复合物的晶体结构，并观察到Tyr203残基侧链存在gauche+ χ1和trans χ1两种旋转异构状态。

图3. xlσ1R开放式和闭合构象对比

（图源：Meng F, Xiao Y., et al., Nat Commun, 2022）

根据以上线索，作者设计了一对半胱氨酸突变体（L179C/Y203C），通过形成二硫键来阻碍xlσ1R在α4和α5螺旋之间的开口形成。结合实验（ITC）结果显示，配体PRE084结合xlσ1R随二硫键形成而相应受阻，并在二硫键被还原后相应恢复（图4）。这说明限制α4和α5螺旋的相对移动可以阻碍xlσ1R与配体的结合。此外，作者还通过分别单独修饰L179C或Y203C，验证了增加这一位置的空间位阻同样会相应阻碍受体与配体的结合（图4）。这些结果进一步支持了作者的论点。

图4. xlσ1R_C179/C203突变体对底物结合的影响

（图源：Meng F., Xiao Y., et al., Nat Commun, 2022）

作者还从结构角度验证了L179C/Y203C突变体的结构功能完整性。xlσ1R_{C179/C203-S1RA}结构不仅证明xlσ1R在突变后仍保持完整且与野生型相似的空间结构，更重要的是，突变受体保留了配体（如S1RA）结合能力（图5）。

图5. xlσ1R_C179/C203突变体结构

（图源：Meng F., Xiao Y., et al., Nat Commun, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上，本研究通过X-射线晶体衍射解析了非洲爪蟾sigma-1受体开放式和闭合结构，显示sigma-1受体的配体通过α4和α5螺旋之间的开口进入受体β-桶内的配体结合位点。通过ITC测定了此开口正常和受限状态下受体与配体间结合参数的变化，作者进一步验证了他们的论点。同时作者还尝试了使用加长型配体DIM-3C对xlσ1R晶体进行浸泡实验，试图获得配体延伸出受体结合口袋的结构。虽然这一尝试未能成功，但作者在xlσ1R_{C179/C203-S1RA}结构中发现了一个配体S1RA分子结合于α4和α5螺旋之间的开口处，与PATH2吻合。但由于此结构分辨率较低（3.80埃），作者仅对其进行了探讨。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-28946-w

四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室/罕见病中心/中西医结合科的孙子宜研究员与周小明研究员为该文通讯作者，孟富慧博士、博士研究生肖杨为共同第一作者，硕士研究生姬玉佳参与该研究的部分工作。

孙子宜研究员（左），周小明研究员（右）。

（照片提供自四川大学华西医院孙子宜/周小明团队）

通讯作者简介：

孙子宜博士现于四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室/罕见病中心/中西医结合科任研究员、硕士生导师（课题组网页https://www.x-mol.com/groups/mapsaid）。致力于重大疾病中相关膜蛋白的结构功能研究，在Nat Commun、J Neurosci、JBC、Transl Psychiatry、Acta Cryst D等国际知名期刊上以第一作者或通讯作者身份发表研究论文10余篇，应邀参与英文著作编著1篇。入选四川省级人才计划。

周小明博士现于四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室/罕见病中心/中西医结合科任研究员、博士生导师（课题组网页https://www.x-mol.com/groups/mapsaid）。重点研究方向是重大疾病中（包括神经精神类疾病、代谢类疾病、病毒等）相关膜蛋白的结构功能研究，在Nature、Nat Commun、PNAS、JBC、Acta Cryst D等国际知名期刊上以通讯作者或第一作者身份发表研究论文10余篇，应邀参与英文著作编著2篇。入选国家级和四川省级人才计划。

课题组研究领域与兴趣：

1. 疾病相关跨膜蛋白的结构功能研究。

2. 膜蛋白互作的结构功能网络研究。

3. 靶向膜蛋白及其互作的药物研究。

4. 膜蛋白研究的方法学研究。

欢迎有志于课题组相关领域研究的博士后和研究生加盟，联系邮箱：[e-mail]。

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[1] Maurice T., Phan V.L., Urani A., et al. Neuroactive Neurosteroids as Endogenous Effectors for the Sigma1 (σ1) Receptor: Pharmacological Evidence and Therapeutic Opportunities[J]. The Japanese Journal of Pharmacology, 1999.

[2] Kim F.J., Maher C.M. Sigma1 Pharmacology in the Context of Cancer[M]. 2017.

[3] Schmidt H.R., Zheng S., Gurpinar E., et al. Crystal structure of the human σ1 receptor[J]. Nature, 2016.

制版︱王思珍

本文完